Фазово-контрастная микроскопия

Аватара пользователя
oldTor
Сообщения: 1811
Зарегистрирован: 08 сен 2015, 13:28
Контактная информация:

Фазово-контрастная микроскопия

Сообщение oldTor » 28 мар 2024, 21:54 #1

Краткая информация о том, с чем это едят: https://ru.wikipedia.org/wiki/Фазово-ко ... икроскопия

Я начал своё знакомство с данным методом контрастирования с советским набором КФ-4:
https://scopica.ru/proj/ustroystvo-dlya ... asta-kf-4/
Которому предшествовали и другие - КФ-1, например: https://scopica.ru/proj/ustroystvo-dlya ... stov-kf-1/

Был ещё КФ-3 - для отражённого света, огромная редкость! Я так понимаю, эта технология вообще заглохла потом. Но попробовать такой было бы интересно... Правда я за последние года два регулярного поиска - ни разу на такой не наткнулся... Вот так он выглядел: https://scopica.ru/proj/ustroystvo-fazo ... tnoe-kf-3/

Очень полезная тема по нюансам настройки и возможности комбинирования конденсора КФ-4 и других фазовых конденсоров с фазовыми объективами других систем:
Фазовый конденсор КФ-4 и фазовый контраст (методика)
https://forum.shvedun.ru/viewtopic.php?f=6&t=1349

Существует довольно широкий спектр фазово-контрастных наборов, как старых, так и совсем современных, в т.ч. китайских, и довольно неплохих, но я пока решил ограничиться "старым-добрым КФ-4". Правда, он у меня не полностью комплектный. Конденсор мне попал действительно, в "состоянии нового", хотя он 1967 года (даже диафрагма не застыла наглухо), но прочий набор был разнороден. Отсутствие МИР-4 меня не напрягло - я могу настраивать и без него, уже доводилось у знакомых юзать подобный набор ранее, так что представление уже имелось. Огорчило отсутствие 20х объектива. При том 40х и 90х - судя по серийнику - "родные" для конденсора. Вместо 10-ки родной, наличествовала 10-ка от набора КФ-1 с красной буквой "Ф" в маркировке на "рубашке" объектива.

90х я пока не пробовал, так как он иммерсионный, и у меня просто не дошли руки, а вот 40-ку я поюзал подробно. И тут мне очень помогла тема, на которую выше дал ссылку (ну и ещё некоторые темы на зарубежных ресурсах) - дело в том, что хотя фазовое кольцо объектива вроде бы достаточно контрастное, не особо слабовато, но есть у меня подозрение, что хотя объектив и комплектный для данного конденсора, но не очень хорошо совпадает - я с разными осветителями, включая штатный, микроскопа МББ-1А настраивал этот объектив и не добился идеального совпадения фазовых колец ни в положении конденсора "40", ни в положении "20", которое в принципе тоже для него относительно рабочее. Дело, кмк, как уже подобную проблему описывали другие - в некотором несовпадении не то чтобы калибра, а ширины колец в конденсоре и объективе.
Однако я сделал с ним пару работ, которые мне понравились.

Да, давненько я не возвращался к "конечному" тубусу микроскопа) Тубус я составил довольно длинный, обеспечив масштаб съёмки при прямой проекции на матрицу кроп 1,5 такой, чтобы при использовании объектива 40х0.65 Ф - у меня по длинной стороне кадра вмещалось 400мкм. Т.е. фактический масштаб съёмки, вместо такого, который был бы при штатной оптической длине тубуса (40:1), у меня составил примерно 59:1. Но поскольку объективы - обычные ахроматы тут, то это отчасти вынужденная мера, чтобы "раздуть" более-менее ровный геометрически центр поля на большую часть кадра. Да, в тубус, составленный из секций с резьбами м42 ещё добавил дополнительно ирисовую диафрагму, для блокировки возможных засветок - практика показала, что не зря - закрытие этой диафрагмы до точки, после которой она начинает работать как полевая и давать виньетирование - явно благотворно влияет на картинку.

Конечно, фазовый контраст обеспечивает при первом знакомстве с ним "вау-эффект") Однако, "за всё надо платить", и важно помнить, что это, в первую очередь не средство получения "красивых картинок", а насущный научный рабочий инструмент с момента его создания. Так что ограничений он накладывает немало, как любой узкоспециальный профессиональный инструмент.
Даже толщина самого простейшего и всем известного препарата, такого как кожица лука - уже довольно велика для того, чтобы он показал себя во всей красе при работе с объективом мощнее 10х0.30. Ну и гало-эффект, как неизбежное сопровождение данного метода контрастирования, здорово мешает, например, делать стэкинг по фокусировке. Хотя он возможен с довольно приличным результатом, с некоторыми объектами наблюдения. Хроматика себя ведёт от "не мешает совсем" до "мешает зверски", в зависимости от объекта наблюдения/съёмки, причём в основном, от его толщины, насколько я понимаю.

В общем, несмотря на явную недостаточно хорошую дружбу комплектного объектива 40х0.65 Ф с его расчётной фазовой диафрагмой конденсора, пару снимков мне вполне, я считаю, удались:

Клетки лука. Фазовый контраст КФ-4, объектив 40х0.65 Ф-МЩ. Микроскоп МББ-1А. Прямая проекция на матрицу. Масштаб съёмки 59:1, кадрирование:

ИзображениеOnion cells. Phase contrast. 59:1

Тут мне явно мешала вылезшая хроматика объектива и я её нещадно "жал программно".

Но с менее толстыми объектами, она не представляет особых проблем и не сильно выделяется на фоне прочих возникающих окрасок. Вот, к примеру, тут - картинка выглядит по окраске и прочим признакам куда более типично для фазового контраста, и при том, хроматика не лезет настырно в глаза, а я её не правил:

Кристалл йодида калия. Фазовый контраст КФ-4, объектив 40х0.65 Ф-МЩ. Микроскоп МББ-1А. Прямая проекция на матрицу. Масштаб съёмки 59:1, кадрирование:

ИзображениеPotassium iodide crystal. Phase contrast. 59:1 by oldTor, on Flickr

В общем, несмотря на неидеальность настройки фазовых колец, собственно фазовый контраст получается вполне недурно. Я ещё смотрел разные объекты, которые не снял, либо снял недостаточно хорошо, чтобы их готовить к публикации, и в целом мне всё нравится. Хочу опробовать этот метод в т.ч. в наблюдении абразивных суспензий, в которых в обычном свете частицы плохо видны.

Но вернусь немного назад, к объективу 10х - как я уже сказал, он у меня от набора КФ-1 и аж 1951 года! И надо сказать - мне он просто ОЧЕНЬ понравился.
Да, это ахромат, просто ахромат, но какой! С тем же фототубусом, что и для 40х, он дал мне масштаб съёмки около 15,4:1 и при том обеспечил весьма достойную ширину довольно ровного поля - добрых микрон 600, а то и700. Дальше немного "уплывает", но тесты показали, что кривизна вполне корректируемая при стэкинге - аберрации не столь колоссальны, чтобы не дать нормально сшить. При том, резкость в центре шикарная -т.е. отличительная черта любого хорошего ахромата тут на высоте. Я снял с ним объект-микрометр, причём отражённого света - это довольно тёмное кварцевое стекло, и он даже "взял" его "на просвет", причём весьма резко и контрастно в центре кадра, если смотреть в оригинальном размере - так этот объект "насквозь прострелить" обычные светлопольные объективы не могут- камджипег с авто ББ:
Изображение

Я с ним кое-что снял, но пока не опубликовал - это будет чуть позже, так как хочу попробовать не совсем обычную обработку, но уже настолько порадовался результату, что прикупил ещё объектив 40х тоже от КФ-1 - в надежде, что он окажется для моего конденсора КФ-4 так же хорош, как оказался 10х0.30 Ф, и может быть окажется лучше "родной" сороковки.
Я пока не разобрался детально в том, насколько адекватно соответствует числовая апертура фазовых объективов реальной, так как фазовое кольцо её неизбежно "режет", да и это заметно по тому, что ГРИП у фазового объектива по сравнению с таким же, не фазовым - глубже, потому посчитать, например, эффективную диафрагму с точки зрения матрицы я адекватно пока не могу. Но я попробую разобраться - надо почитать кое-что, мне уже попадались мельком разборы этих аспектов. Но суть в том, что даже если апертура и режется, всё равно, данным методом можно легко наблюдать то, что либо никак, либо очень скверно видно в светлом поле проходящего света. Косое освещение и темнопольное могут иногда "побороться" с ФК в плане плохоразличимых объектов, но тут уже многое зависит от конкретного объекта. Например, если можно структуру клеток дрожжей в косом освещении просто увидеть рельефно, то вот детали их уже без ФК не видно. Попробую потом может быть сделать сравнение, тем более, что в высоком разрешении я в косом свете дрожжевые клетки недавно снял недурно: https://www.flickr.com/photos/oldtor/53 ... ateposted/

В общем, пока что я очень доволен КФ-4 и надеюсь сделать с ним немало интересных работ.

Аватара пользователя
oldTor
Сообщения: 1811
Зарегистрирован: 08 сен 2015, 13:28
Контактная информация:

Фазово-контрастная микроскопия

Сообщение oldTor » 30 мар 2024, 19:57 #2

Буккальный эпителий. Фазовый контраст. Объектив 40х0.65 Ф из набора КФ-1 с фазовой диафрагмой конденсора КФ-4.
Микроскоп МББ-1А. Прямая проекция на матрицу. Масштаб съёмки 59:1, кадрирование

Изображение

Аватара пользователя
oldTor
Сообщения: 1811
Зарегистрирован: 08 сен 2015, 13:28
Контактная информация:

Фазово-контрастная микроскопия

Сообщение oldTor » 31 мар 2024, 10:30 #3

Кристалл йодида калия. Фазовый контраст. Объектив 10х0.30 Ф 1951 года из набора КФ-1 с фазовой диафрагмой конденсора КФ-4 с синим светофильтром. Микроскоп МББ-1А. Прямая проекция на матрицу. Масштаб съёмки 15:1, кадрирование. Пиксель-шифт из 6-ти кадров вручную, со сшивкой в фотошопе.

ИзображениеPotassium iodide crystal. Phase contrast. 15:1

Аватара пользователя
oldTor
Сообщения: 1811
Зарегистрирован: 08 сен 2015, 13:28
Контактная информация:

Фазово-контрастная микроскопия

Сообщение oldTor » 12 апр 2024, 19:15 #4

Амилопласты, зёрна картофельного крахмала. Фазовый контраст с поляризацией и самодельным компенсатором. Микрофото с объективом 40х0.65 Ф из набора КФ-1 с фазовой диафрагмой конденсора КФ-4 на штативе микроскопа МББ-1А. Прямая проекция на матрицу кроп 1,5. Масштаб съёмки 56:1

ИзображениеAmyloplasts, potato starch grains. Phase contrast & Polarization. 56:1

Аватара пользователя
oldTor
Сообщения: 1811
Зарегистрирован: 08 сен 2015, 13:28
Контактная информация:

Фазово-контрастная микроскопия

Сообщение oldTor » 14 апр 2024, 12:17 #5

О практическом применении фазового контраста в ракурсе абразивов, с фотопримерами - в посте 181 по ссылке:

viewtopic.php?f=8&t=152&p=10303#p10303

Аватара пользователя
oldTor
Сообщения: 1811
Зарегистрирован: 08 сен 2015, 13:28
Контактная информация:

Фазово-контрастная микроскопия

Сообщение oldTor » 18 апр 2024, 10:32 #6

Кристалл йодида калия. Фазовый контраст КФ-4, объектив 40х0.65 Ф-МЩ 1967 года. Микроскоп МББ-1А. Прямая проекция на матрицу. Cтэкинг 4 кадра. Масштаб съёмки 53,4:1, кадрирование.

ИзображениеPotassium iodide crystal. Phase contrast. 53:1

Аватара пользователя
oldTor
Сообщения: 1811
Зарегистрирован: 08 сен 2015, 13:28
Контактная информация:

Фазово-контрастная микроскопия

Сообщение oldTor » 20 апр 2024, 16:03 #7

Крайне редко использую афокальную систему, но вот намедни как раз применил.

Поперечный срез завязи лилии. Фрагмент готового казённого окрашенного препарата. Фазовый контраст КФ-4, объектив 40х0.65 Ф-МЩ 1967 года. Микроскоп МББ-1А. Афокальная проекция на матрицу кроп 1,5 с помощью окуляра К10х и макрообъектива Olympus OM-System Zuiko Auto-Macro 50mm f/3.5. Масштаб съёмки 84:1, кадрирование: по горизонтали снимка ~210мкм.

ИзображениеOvary of lilium. Fragment. Phase Contrast. 84:1

Для сравнения, тот же участок препарата в светлом поле с обычной сороковкой 40х0.65 в том же масштабе и при той же системе съёмки - фотка кликабельна:
Изображение

Предвосхищая вопрос, зачем потребовался компенсационный окуляр: я пробовал разные, в т.ч. и обычный 10х, так вот с компенсационной десяткой чёткость и контраст оказались повыше. Что касаемо ХА - всё равно они в обоих вариантах присутствуют в той или иной степени и в той или иной степени правятся при проявке равов.

Ну и мне показалось, что это недурной пример ситуации, когда съёмка в ФК и окрашенного препарата может оказаться полезной.


Вернуться в «Оптика и фото»

Кто сейчас на конференции

Сейчас этот форум просматривают: нет зарегистрированных пользователей и 26 гостей